紫背天葵的高效液相色谱法指纹图谱分析

邵考珍何淑莹

佛山医院，广东

目的探讨紫背天葵的高效液相色谱法（HPLC）指纹图谱。方法采用色谱柱Shim-packVP-ODS（mm×4.6mm，5μm）；以0.5%H3pO4（V/V）为流动相A，以50%乙腈为流动相B（V/V），进行梯度洗脱；流速为0.8ml/min；柱温30℃；检测波长为nm；进样量10μl；运行时间为80min。理论板数按矢车菊素-3-O-葡萄糖苷计算，不得低于。结果建立了紫背天葵的HPLC指纹图谱。讨论采用HPLC构建“紫背天葵”指纹图谱，探讨指纹图谱的技术要点及检测条件，以能反映该品种整体特征的HPLC指纹图谱作为质量评价方法，对现有质量控制方法作出积极而又必要的补充和提高，为建立统一的质量标准奠定基础，从而建立新的质量标准。

紫背天葵；高效液相色谱法；指纹图谱

紫背天葵是秋海棠科秋海棠属的多年生无茎草本植物，别名为红天葵、红叶、红水葵、散血子等，分布于中国的广东、福建、江西、海南、香港、湖南、广西、浙江等地，生长于海拔m至m的地区，一般生长于悬崖石缝中、山地山顶疏林下石上、山顶林下潮湿岩石上及山坡林下。其可做清凉饮料，具有清热解毒、凉血活血及润肺止咳的功效，主治暑热高热、肺热咳嗽咯血、跌打扭伤、血瘀疼痛、疮毒疥癣、水火烫伤等[1-3]。近年来，随着研究的逐步开展，紫背天葵的新作用和用途不断被发现。现代研究表明，紫背天葵主要含有大量花色苷、黄酮苷、氨基酸、活性多糖化合物、生物碱和微量元素等有效活性成分，以矢车菊素-3-O-葡萄糖苷、矢车菊-3-O-芸香糖苷等花色苷为主要活性化学成分[4-8]。目前，相关研究报道除少量药理研究外，主要集中于不同成分的提取及稳定性研究上，而对质量控制和质量标准的研究极其罕见[9]，对高效液相色谱法（HPLC）指纹图谱的研究则未见报道。由于市面上紫背天葵的质量良莠不齐，不同产地的紫背天葵疗效差距较大，本研究拟采用HPLC构建紫背天葵的指纹图谱，以便建立能反映该品种整体特征的质量评价方法，从而保证中药质量稳定、保证临床疗效和使用安全，同时更有利于开发新的临床应用，促进资源有效的规范化和规模化开发利用。

1仪器与试剂

1.1仪器Agilent高效液相色谱仪，包括四元泵、脱气机、二极管阵列检测器、柱温箱；Chemstation工作站；HN-型超声波清洗机（广州市华南超声设备有限公司）。

1.2药品与试剂矢车菊素-3-O-葡萄糖苷对照品（Hyphytochem公司，批号：，纯度：≥98%）；甲醇、乙腈为色谱纯，其他试剂为分析纯，水为高纯水。广东、广西、湖南、福建等不同产地的紫背天葵经广州市皮肤病防治所副主任中药师龙惠鉴定，均为秋海棠科秋海棠属干燥全草。

2方法与结果

2.1供试品溶液的制备取紫背天葵药材粉碎并过40目筛。精密称取粉末1g，置于具塞锥形瓶中，精密加甲醇25ml，称定质量，超声处理30min。取出，冷却至室温，再称定质量，用甲醇补足减少重量。摇匀，滤纸滤过，再以0.45μm滤膜滤至进样瓶，即为供试品溶液。

2.2对照品溶液的制备精密称取矢车菊素-3-O-葡萄糖苷对照品适量，加甲醇制成0.1mg/ml溶液，避光保存，作为对照品溶液。

2.3色谱条件色谱柱：Shim-packVP-ODS（mm×4.6mm，5μm）；以0.5%H3pO4（V/V）为流动相A，50%乙腈为流动相B（V/V），按表1程序进行梯度洗脱；流速：0.8ml/min；柱温：30℃；检测波长：nm；进样量：10μl；运行时间：80min。理论板数按矢车菊素-3-O-葡萄糖苷计算，不低于。梯度洗脱程序见表1。

2.4方法学考察

2.4.1精密度试验取同一批紫背天葵供试品溶液，连续进样6次，记录色谱图。以矢车菊素-3-O-葡萄糖苷为参照峰，计算主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的相对标准偏差（RSD）。结果显示，各色谱峰的相对保留时间的RSD%≤0.1%，相对峰面积的RSD%＜1%。另以第1次测定的色谱图为参照，使用相似度计算软件计算相似度，相似度平均值为0.。试验结果表明，该方法的精密度良好（表2）。

2.4.2稳定性试验取同一份紫背天葵供试品溶液，分别于0、2、4、8、12、18、24h进样测定，记录色谱图。以矢车菊素-3-O-葡萄糖苷为参照峰，计算主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD。结果显示，各色谱峰的相对保留时间的RSD%＜1%，相对峰面积的RSD%＜3%。另以第1次测定的色谱图为参照，使用相似度计算软件计算相似度，相似度平均值为0.。表明供试品溶液在24h内稳定性良好（表3）。

2.4.3重复性试验取同一批供试品6份分别进样测定，记录色谱图。以矢车菊素-3-O-葡萄糖苷为参照峰，计算主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD。结果显示，各色谱峰的相对保留时间的RSD%＜1%，相对峰面积的RSD%＜3%。另以第1份测定的色谱图为参照，使用相似度计算软件计算相似度，相似度平均值为0.。结果见表4。

2.5指纹图谱及解析

2.5.1共有峰标记通过对10批紫背天葵进行了指纹图谱的分析，以矢车菊素-3-O-葡萄糖苷为参考峰，标定了25个共有峰。分别为1号（5.min）、2号（7.min）、3号（8.min）、4号（10.min）、5号（11.min）、6号（12.min）、7号（14.min）、8号（16.min）、9号（16.min）、10号（16.min）、11号（18.min）、12号（18.min）、13号（19.min）、14号（19.min）、15号（22.min）、16号（26.min）、17号（39.min）、18号（39.min）、19号（42.min）、20号（42.min）、21号（43.min）、22号（45.min）、23号（46.min）、24号（47.min）、25号（50.min）。见图2。

2.5.2相似度计算本研究采用中国药典委员会推荐的中药色谱指纹图谱相似度评价系统（年A版），对10批不同产地的紫背天葵样品HPLC图谱进行评价，通过与系统生成的对照图谱进行比较，得到各种来源的供试品相似度在0.～0.。结果见表5及图1～3。

3讨论

3.1供试品制备方法的考察根据文献资料，曾试验以体积分数分别为50%、60%、70%、80%、90%、%的甲醇为溶剂。从HPLC图谱看，50%甲醇HPLC图谱杂质最多、基线不平，其他浓度依次改善，%甲醇最佳。采用超声30min的方法进行提取，操作简单、图谱特征稳定。

3.2色谱条件的优化曾试验过的流动相系统有以下两种：①乙腈-（0.1%～0.5%）磷酸溶液；②（0.1%～0.5%）磷酸溶液-50%乙腈，经过试验发现：0.5%磷酸溶液-50%乙腈按表1的程序进行梯度洗脱，所得色谱峰的数量、分离度、分布均匀程度最高。以每分钟0.8ml的流速至80min时色谱峰已完全洗脱。

3.3小结采用HPLC构建“紫背天葵”指纹图谱，以能反映该品种整体特征的HPLC指纹图谱作为质量评价方法，对现有质量控制方法作出积极而又必要的补充和提高，为建立统一的质量标准奠定基础，从而可以建立新的质量标准，更进一步加强对紫背天葵的质量控制，保证临床用药的安全有效，开发新的临床应用，促进资源有效的规范化和规模化开发。

参考文献

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[2]中华人民共和国国家医药管理局《中华本草》编委会.中华本草[M].上海:上海科技出版社,:-.

[3]中国中药编辑委员会.中国本草[M].上海:上海科学技术出版社,:.

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